Prodotti
Kit ta' skoperta Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR għal 2019-nCoV
Użu mistenni
Dan il-kit jintuża għad-detezzjoni kwalitattiva tal-coronavirus il-ġdid (2019-nCoV) bl-użu ta' swabs tal-gerżuma, swabs nażofarinġali, fluwidu tal-ħasil bronkoalveolari, sputum. Ir-riżultat tad-detezzjoni ta' dan il-prodott huwa biss għal referenza klinika, u m'għandux jintuża bħala l-unika evidenza għal dijanjosi klinika u trattament. Analiżi komprensiva tal-kundizzjoni hija rakkomandata flimkien mal-manifestazzjonijiet kliniċi tal-pazjent u testijiet oħra tal-laboratorju.
Prinċipju ta' spezzjoni
Il-kit huwa bbażat fuq teknoloġija RT-PCR f'pass wieħed. Fil-fatt, il-ġeni ORF1ab u N tal-coronavirus il-ġdid tal-2019 (2019-nCoV) intgħażlu bħala r-reġjuni fil-mira tal-amplifikazzjoni. Primers speċifiċi u sondi fluworexxenti (is-sondi tal-ġeni N huma ttikkettjati b'FAM u s-sondi ORF1ab huma ttikkettjati b'HEX) huma ddisinjati biex jidentifikaw l-RNA tal-coronavirus tat-tip ġdid tal-2019 fil-kampjuni. Il-kit jinkludi wkoll sistema ta' skoperta ta' kontroll intern endoġenu (sonda tal-ġeni ta' kontroll intern immarkata b'CY5) biex timmonitorja l-proċess tal-ġbir tal-kampjuni, l-RNA u l-amplifikazzjoni tal-PCR, u b'hekk tnaqqas ir-riżultati negattivi foloz.
Komponenti ewlenin
| Komponenti | Volum(48T/Kit） |
| Soluzzjoni ta' reazzjoni RT-PCR | 96µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864µl |
| Kontroll negattiv | 1500µl |
| Kontroll pożittiv nCOV (l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
Reaġenti proprji: Reaġenti ta' estrazzjoni jew purifikazzjoni tal-RNA. Kontroll negattiv/pożittiv: Il-kontroll pożittiv huwa RNA li fih il-framment fil-mira, filwaqt li l-kontroll negattiv huwa ilma ħieles mill-aċidu nuklejku. Waqt l-użu, għandhom jipparteċipaw fl-estrazzjoni u għandhom jitqiesu bħala infettivi. Għandhom jiġu mmaniġġjati u mormija skont ir-regolamenti rilevanti.
Il-ġene ta' referenza interna huwa l-ġene RnaseP uman.
Kundizzjonijiet tal-ħażna u data ta' skadenza
-20±5℃, evita l-iffriżar u t-tidwib ripetuti aktar minn 5 darbiet, validu għal 6 xhur.
Strument applikabbli
Ma' FAM / HEX / CY5 u strumenti oħra tal-PCR fluworexxenti b'ħafna kanali.
Rekwiżiti tal-kampjuni
1. Tipi ta' kampjuni applikabbli: kampjuni tal-gerżuma, kampjuni nażofarinġali, fluwidu tal-lavaġġ bronkoalveolari, sputum.
2. Ġbir ta' kampjuni (teknika asettika)
Tampun farinġali: Imsaħ it-tonsilli u l-ħajt farinġali ta' wara b'żewġ tampuni fl-istess ħin, imbagħad għaddas ras it-tampun f'tubu tat-test li fih is-soluzzjoni tal-kampjunar
Sputum: Wara li l-pazjent ikollu sogħla profonda, iġbor l-isputum tas-sogħla f'tubu tat-test b'tapp bil-kamin li fih is-soluzzjoni tal-kampjunar; fluwidu tal-lavaġġ bronkoalveolari: Kampjunar minn professjonisti mediċi. 3. Ħażna u trasport tal-kampjuni
Kampjuni għall-iżolament tal-virus u ttestjar tal-RNA għandhom jiġu ttestjati mill-aktar fis possibbli. Kampjuni li jistgħu jiġu skoperti fi żmien 24 siegħa jistgħu jinħażnu f'4℃; dawk li ma jistgħux jiġu skoperti fi żmien 24
sigħat għandhom jinħażnu f'temperatura ta' -70℃ jew inqas (jekk ma jkunx hemm kundizzjoni ta' ħażna ta' -70℃, għandhom ikunu
(maħżun temporanjament f'temperatura ta' -20℃ fil-friġġ). Il-kampjuni għandhom jevitaw li jiġu ffriżati u mdewba ripetutament waqt it-trasport. Il-kampjuni għandhom jintbagħtu lill-laboratorju mill-aktar fis possibbli wara l-ġbir. Jekk il-kampjuni jeħtieġu li jiġu ttrasportati fuq distanzi twal, huwa rakkomandat il-ħażna bis-silġ niexef.
Metodi ta' Test
1 Ipproċessar ta' kampjuni u estrazzjoni ta' RNA (żona ta' pproċessar ta' kampjuni)
Huwa rakkomandat li tieħu 200μl ta' kampjun likwidu għall-estrazzjoni tal-RNA. Għal passi relatati mal-estrazzjoni, irreferi għall-istruzzjonijiet tal-kits kummerċjali tal-estrazzjoni tal-RNA. Kemm in-negattiv kif ukoll in-negattiv
Il-kontrolli f'dan il-kit kienu involuti fl-estrazzjoni.
2 Preparazzjoni tar-reaġent tal-PCR (żona ta' preparazzjoni tar-reaġent)
2.1 Neħħi l-komponenti kollha mill-kit u ħollhom u ħallathom f'temperatura tal-kamra. Iċċentrifuga b'8,000 rpm għal ftit sekondi qabel l-użu; ikkalkula l-ammont meħtieġ ta' reaġenti, u s-sistema ta' reazzjoni tiġi ppreparata kif muri fit-tabella li ġejja:
| Komponenti | Porzjon N (sistema ta' 25µl) |
| nCOV primer TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| Soluzzjoni ta' reazzjoni RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = numru ta' kampjuni ttestjati + 1 (kontroll negattiv) + 1 (nCOV)kontroll pożittiv) | |
2.2 Wara li tħallat il-komponenti sew, iċċentrifuga għal żmien qasir biex tħalli l-likwidu kollu fuq il-ħajt tat-tubu jaqa' fil-qiegħ tat-tubu, u mbagħad alikwotta s-sistema ta' amplifikazzjoni ta' 20 µl fit-tubu tal-PCR.
3 Kampjunar (żona ta' preparazzjoni tal-kampjun)
Żid 5μl tal-kontrolli negattivi u pożittivi wara l-estrazzjoni. L-RNA tal-kampjun li għandu jiġi ttestjat jiżdied mat-tubu tar-reazzjoni tal-PCR.
Għatti t-tubu sewwa u ċċentrifuga b'8,000 rpm għal ftit sekondi qabel ma tittrasferih lejn iż-żona ta' skoperta tal-amplifikazzjoni.
4 Amplifikazzjoni tal-PCR (żona ta' skoperta amplifikata)
4.1 Poġġi t-tubu tar-reazzjoni fiċ-ċella tal-kampjun tal-istrument, u ssettja l-parametri kif ġej:
| stadju | Ċiklu numru | Temperatura(°Ċ) | Ħin | ġabrasit |
| Bil-maqlubtraskrizzjoni | 1 | 42 | 10 minuti | - |
| Pre-denaturazzjonin | 1 | 95 | minuta | - |
| Ċiklu | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | tletinijiet | ġbir ta' dejta |
Għażla tal-kanal tad-detezzjoni tal-istrument: Agħżel il-kanal FAM、HEX、CY5 għas-sinjal tal-fluworexxenza. Għal fluworexxenza ta' referenza NONE, jekk jogħġbok tagħżilx ROX.
5 Analiżi tar-riżultati (Jekk jogħġbok irreferi għall-istruzzjonijiet sperimentali ta' kull strument għas-settings)
Wara r-reazzjoni, salva r-riżultati. Wara l-analiżi, aġġusta l-valur tal-bidu, il-valur tat-tmiem, u l-valur tal-limitu tal-linja bażi skont l-immaġni (l-utent jista' jaġġusta skont is-sitwazzjoni attwali, il-valur tal-bidu jista' jiġi ssettjat għal 3~15, il-valur tat-tmiem jista' jiġi ssettjat għal 5~20, aġġustament) fil-graff logaritmika. Fil-limitu tat-tieqa, il-linja tal-limitu tinsab fil-fażi logaritmika, u l-kurva tal-amplifikazzjoni tal-kontroll negattiv hija linja dritta jew taħt il-linja tal-limitu).
6 Kontroll tal-kwalità (Kontroll proċedurali huwa inkluż fit-test) Kontroll negattiv: L-ebda kurva ta' amplifikazzjoni ovvja għall-kanali ta' skoperta FAM, HEX, CY5
Kontroll pożittiv tas-COV: kurva ta' amplifikazzjoni ovvja tal-kanali ta' skoperta FAM u HEX, valur Ct ≤32, iżda l-ebda kurva ta' amplifikazzjoni tal-kanal CY5;
Ir-rekwiżiti ta' hawn fuq iridu jiġu ssodisfati simultanjament fl-istess esperiment; inkella, l-esperiment ma jkunx validu u jkollu jiġi ripetut.
7 Determinazzjoni tar-riżultati.
7.1 Jekk ma jkun hemm l-ebda kurva ta' amplifikazzjoni jew valur Ct > 40 fil-kanali FAM u HEX tal-kampjun tat-test, u jkun hemm kurva ta' amplifikazzjoni fil-kanal CY5, jista' jiġi ġġudikat li m'hemm l-ebda RNA tal-coronavirus il-ġdid tal-2019 (2019-nCoV) fil-kampjun;
.2 Jekk il-kampjun tat-test għandu kurvi ta' amplifikazzjoni ovvji fil-kanali FAM u HEX, u l-valur Ct huwa ≤40, jista' jiġi ġġudikat li l-kampjun huwa pożittiv għall-coronavirus il-ġdid tal-2019 (2019-nCoV).
7.3 Jekk il-kampjun tat-test ikollu kurva ta' amplifikazzjoni ċara f'kanal wieħed biss ta' FAM jew HEX, u l-valur Ct huwa ≤40, u ma jkun hemm l-ebda kurva ta' amplifikazzjoni fil-kanal l-ieħor, ir-riżultati jeħtieġ li jiġu ttestjati mill-ġdid. Jekk ir-riżultati tat-test mill-ġdid ikunu konsistenti, il-kampjun jista' jiġi ġġudikat bħala pożittiv għall-ġdid.
coronavirus 2019 (2019-nCoV). Jekk ir-riżultat tat-test mill-ġdid ikun negattiv, jista' jiġi ġġudikat li l-kampjun huwa negattiv għall-coronavirus il-ġdid tal-2019 (2019-nCoV).
Valur ta' ġudizzju pożittiv
Il-metodu tal-kurva ROC jintuża biex jiġi ddeterminat il-valur tas-CT ta' referenza tal-kit u l-valur ta' referenza tal-kontroll intern huwa 40.
Interpretazzjoni tar-riżultati tat-test
1. Kull esperiment għandu jiġi ttestjat għal kontrolli negattivi u pożittivi. Ir-riżultati tat-test jistgħu jiġu determinati biss meta l-kontrolli jissodisfaw ir-rekwiżiti tal-kontroll tal-kwalità.
2. Meta l-kanali ta' skoperta FAM u HEX ikunu pożittivi, ir-riżultat mill-kanal CY5 (kanal ta' kontroll intern) jista' jkun negattiv minħabba l-kompetizzjoni tas-sistema.
3. Meta r-riżultat tal-kontroll intern ikun negattiv, jekk il-kanali ta' skoperta FAM u HEX tat-tubu tat-test ikunu wkoll negattivi, dan ifisser li s-sistema hija diżattivata jew l-operazzjoni hija żbaljata, u t-test mhux validu. Għalhekk, il-kampjuni jeħtieġ li jerġgħu jiġu ttestjati.
